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提取組織器官RNA|凈信多樣品組織勻漿機實驗案例

發布時間:2020/07/24 點擊量:

組織樣品中RNA的提取實驗:本實驗的組織樣品主要有小鼠的各個組織器官(如肝臟,肌肉,脂肪等)和人腫瘤標本(如結直腸癌,肺癌,乳腺癌)
 


  1.首先要根據需要抽提的組織樣品的質量加入相應的TRIZOL液體,同時加入若干顆不銹鋼柱。本實驗室一般情況如下:(小鼠組織加入TRIZOL,結直腸癌標本加入TRIZOL)

  注意:

  a.用凈信勻漿機進行勻漿處理時樣品體積最好不要超過TRIzol體積10℅)

  b.需事先預冷試管座

  2.把加入樣品,TRIZOL,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預冷好的試管座中。機器設置好參數蓋上蓋子,點擊運行

  3.機器運行完畢后,打開蓋子,拿出凈信EP管仔細觀察組織的研磨情況,如果沒有明顯的塊狀物,那就可以進入下一步實驗步驟,如果沒有完全打碎,還需要把EP管放入試管座中,繼續勻漿。有些堅硬,或者脂肪含量高的組織(乳腺)可能需要稍微長一點的時間,時間可以依據組織實際的研磨情況來調整勻漿時間。

  4.和傳統的TRIZOL提取RNA的方法一樣,將勻漿樣品在室溫放置幾分鐘,使核酸蛋白復合物完全分離。

  5.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩若干秒,室溫放置幾分鐘。

  6.2-8℃10000×g離心十幾分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。

  7.把水相轉移到新管中,如要分離DNA和蛋白質可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入異丙醇,室溫放置幾分鐘。

  8.2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

  9.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心幾分鐘,棄上清。

  10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥,過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入無RNase的水,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應,勿使用SDS溶液。

  常見問題分析:

  1得率低:

  A.樣品裂解或勻漿處理不徹底

  B.RNA沉淀未完全溶解

  C.檢測吸光度時,RNA樣品沒有溶于水,而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高

  D.樣品勻漿時加的試劑量太少

  E.勻漿樣品時未在室溫放置幾分鐘

  F.吸取水相時混入了有機相

  2 RNA降解

  A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍

  B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

  C.細胞在用胰酶處理時過度

  D.溶液或離心管未經RNase去除處理

  E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5

  3 DNA污染:

  A.樣品勻漿時加的試劑量太少

  B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或堿性溶液

  預防RNase污染注意事項:

  1.經常更換新手套,皮膚上常帶有的細菌,霉菌可能成為RNase的來源。

  2.使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。

  3.RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染,但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

  4.配制溶液應使用無RNase的水

  本實驗已經研磨的各個組織中發現肝臟組織是最容易研磨,研磨效率是最好的。

  下圖A是RNA經過傳統的液氮研磨和勻漿器研磨法抽出的RNA跑膠圖,結果很明顯發現這種方法是可行的,是可以代替傳統的方法的。

 


  下圖B是利用組織勻漿器對小鼠的各個組織進行勻漿抽出的RNA跑膠圖。發現在抽提各個組織的RNA的時候也是可行的。
 


  圖C是利用組織勻漿器對人結腸癌標本進行了研磨后抽提出的RNA的跑膠圖。
 


  圖D是小鼠的肝臟組織經過手工研磨和機器勻漿后,最后抽提得到的RNA進行了濃度的測定,結果說明組織勻漿器抽提出得RNA的濃度要顯著高于傳統的手工的方法得到的RNA。
 


  蛋白質的提取

  A.根據需要抽提的組織樣品的質量加入相應的蛋白質裂解液(如RIPA),同時加入3顆不銹鋼柱。(小鼠肝臟組織加入1mlRIPA蛋白裂解液,人結直腸癌組織加入500ulRIPA蛋白裂解液)

  B.把加入樣品,蛋白裂解液,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預冷好的試管座中。機器設置好參數蓋上蓋子,點擊運行。

  以下同上RNA的操作方法

  最終所得到的蛋白質濃度的測定經過BCA試劑盒測定完成的,同時通過SDS-PAGE后經過考馬斯亮藍染色和western blot檢測都發現其要比傳統的方法更加簡便快捷,不容易引起交叉污染。

  更多實驗細節可致電工作人員!

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